Produção heteróloga do D

Jan 12, 2024

Scientific Reports volume 13, Número do artigo: 8551 (2023) Citar este artigo

469 acessos

Detalhes das métricas

A tuberculose (TB) é a segunda principal causa de morte por uma única doença infecciosa, atrás da COVID-19. Apesar de um século de esforços, a atual vacina contra a tuberculose não previne efetivamente a tuberculose pulmonar, promove a imunidade de grupo ou evita a transmissão. Portanto, abordagens alternativas são necessárias. Procuramos desenvolver uma terapia celular que produza um antibiótico eficaz em resposta à infecção por tuberculose. D-cicloserina (D-CS) é um antibiótico de segunda linha para TB que inibe a síntese da parede celular bacteriana. Determinamos que o D-CS é o candidato ideal para a terapia celular anti-TB devido à sua eficácia contra a TB, via biossintética relativamente curta e sua baixa incidência de resistência. O primeiro passo comprometido para a síntese de D-CS é catalisado pela L-serina-O-acetiltransferase (DcsE), que converte L-serina e acetil-CoA em O-acetil-L-serina (L-OAS). Para testar se a via D-CS poderia ser uma profilaxia eficaz para TB, nos esforçamos para expressar DcsE funcional em células A549 como um modelo pulmonar humano. Observamos a expressão de DcsE-FLAG-GFP usando microscopia de fluorescência. DcsE purificado de células A549 catalisou a síntese de L-OAS conforme observado por HPLC–MS. Portanto, as células humanas sintetizam DcsE funcional capaz de converter L-serina e acetil-CoA em L-OAS, demonstrando o primeiro passo para a produção de D-CS em células humanas.

A tuberculose (TB) é uma doença infecciosa principalmente respiratória causada pela bactéria Mycobacterium tuberculosis (Mtb)1. A tuberculose continua sendo uma das principais causas de morte por doença transmissível em todo o mundo, infectando 10 milhões de pessoas e matando 1,5 milhão de pessoas em 20212. A atual A vacina de Bacillus Calmette–Guérin (BCG) para TB tem taxas de proteção variáveis ​​para TB pulmonar que não duram até a idade adulta e podem levar a efeitos adversos (para revisão ver ref.3). Outras tentativas de vacina, como a vacina MVA85A, foram desenvolvidas para complementar o BCG, mas falharam nos ensaios de fase IIIb, portanto, a profilaxia da TB permanece indefinida4.

O desenvolvimento de uma profilaxia eficaz contra a tuberculose apresenta uma oportunidade importante para abordagens alternativas. A história de sucesso da quimioprofilaxia e as terapias gênicas emergentes lançaram as bases para a possibilidade de desenvolver uma profilaxia genética que produza um antibiótico em células humanas (quimioprofilaxia genética). A isoniazida tem sido usada como quimioprofilaxia que diminui a chance de desenvolver TB em 40% em 2 anos ou mais5. As terapias genéticas foram recentemente descobertas como eficazes contra o câncer. A terapia de células T do receptor de antígeno quimérico (CAR-T) modifica geneticamente as células T para incluir um receptor de antígeno quimérico. Isso ajuda as células T a atingir as células cancerígenas, especificamente a leucemia linfoblástica aguda e os grandes linfomas de células B6. Em um ensaio clínico envolvendo crianças com leucemia linfoblástica aguda B para tratamento com CAR T-22, 17 de 20 participantes alcançaram pelo menos um ano de remissão7. Depois que a terapia CAR-T demonstrou que é possível modificar células geneticamente para atingir células cancerígenas, vários métodos alternativos de entrega e terapias baseadas em células foram desenvolvidos8. Devido à eficácia da quimioprofilaxia e ao surgimento da terapia gênica, buscamos explorar a viabilidade de uma quimioprofilaxia genética que produza um antibiótico para prevenir a tuberculose.

Depois de avaliar todos os antibióticos de TB de primeira e segunda linha, selecionamos a via biossintética D-cicloserina (D-CS) como um candidato ideal para quimioprofilaxia genética. Neste estudo, focamos na primeira enzima da via biossintética, L-serina-O-acetiltransferase (DcsE), que produz O-acetil-L-serina (L-OAS) a partir de L-serina e acetil-CoA9 (Fig. . 1). Procuramos testar se a DcsE funcional poderia ser expressa em células A549, um modelo de células pulmonares humanas tipo II10. Transfectamos DcsE marcado com FLAG e Green Fluorescent Protein (GFP) em células A549 e observamos produção de alto nível de DcsE-FLAG-GFP usando microscopia de fluorescência. Observamos a síntese in vitro de L-OAS especificamente por DcsE purificada usando HPLC–MS. Nós fornecemos evidências de que a DcsE funcional pode ser sintetizada em células humanas como um primeiro passo para a síntese profilática de D-CS.