Usando Monolith

Jun 14, 2023

Figura 1:Cromatograma da análise de uma reação IVT usando uma coluna de cromatografia monolítica CIMac PrimaS.

A transcrição in vitro (IVT) é uma etapa crítica na produção de RNA mensageiro (mRNA). Em um webinar de março de 2022, Rok Sekirnik (chefe de desenvolvimento de processos para aplicações de mRNA e DNA plasmidial (pDNA) na BIA Separations, parte da Sartorius) explicou que otimizar as concentrações de reagentes usados ​​durante IVT ajuda a maximizar a quantidade de mRNA produzida. Os desenvolvedores de medicamentos têm grande necessidade de métodos analíticos que possam medir IVT em tempo real. Sekirnik mostrou como as colunas de cromatografia monolítica CIMac PrimaS permitem a análise em linha de IVT, incluindo monitoramento de concentração de trifosfatos de nucleosídeos (NTPs), reagentes de capeamento e plasmídeos.

A apresentação Sekirnik observou que uma molécula de mRNA de 4.000 nucleotídeos, como a apresentada nas vacinas de mRNA contra SARS-CoV-2, é ~1,3 MDa - aproximadamente 10 vezes maior que um anticorpo IgG padrão. O RNA mensageiro também carrega uma carga negativa e se torna hidrofóbico quando exposto a altas concentrações de sal. Para permitir a tradução da proteína, ela deve ter uma tampa 5' e uma cauda poliadenilada (poli-A). As caudas poli-A podem ser codificadas no molde de DNA usado para transcrição ou adicionadas enzimaticamente após IVT. Da mesma forma, caps 5' podem ser adicionados durante ou após IVT.

Considerando tais propriedades, os desenvolvedores de medicamentos precisam de métodos analíticos que possam medir o rendimento do mRNA e a eficiência do capping em tempo real. A cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) é útil para tais avaliações, mas os analistas devem selecionar um meio de separação que forneça uma química de ligação adequada, uma área de superfície suficientemente grande para mRNA e capacidade para análises rápidas. Em meios baseados em grânulos contendo partículas porosas, a difusão limita a transferência de massa, exigindo longos tempos de análise e limitando o potencial para avaliação em linha. Os grânulos também geram fluxo contracorrente, produzindo tensão de cisalhamento que diminui a recuperação.

As colunas monolíticas CIMac PrimaS dependem do transporte de massa por convecção através de uma fase estacionária de polimetacrilato. A separação é baseada em interações multimodais de troca aniônica e ponte de hidrogênio. O fluxo laminar através da coluna minimiza a tensão de cisalhamento. Em comparação com as partículas porosas, os microcanais fornecem muito mais área de superfície para a ligação do mRNA. Como os canais não possuem poros sem saída, sua capacidade de ligação e resolução permanecem as mesmas em todas as taxas de fluxo.

Esse recurso permite que os analistas processem amostras com rapidez suficiente para avaliar o IVT em tempo real sem diminuir a resolução. Sekirnik observou que um ensaio pode separar e quantificar mRNA, pDNA, reagentes de capping e NTPs distintos (Figura 1). Os resultados são gerados em menos de três minutos.

Esses recursos permitem o monitoramento e o controle da cinética de produção de mRNA, incluindo a eficiência de capeamento de 5'. Sekirnik explicou que, se for usada uma exonuclease que degrada seletivamente o mRNA sem tampa, uma amostra pode ser analisada quanto à concentração de mRNA, tratada enzimaticamente e analisada novamente para quantificar as moléculas não digeridas. A comparação dos valores de concentração de antes e depois do tratamento revelará a eficiência de limitação de uma reação IVT. Os analistas podem ajustar os regimes de alimentação e as concentrações de reagentes de acordo para otimizar o capeamento e o rendimento do mRNA.

Sekirnik demonstrou essa possibilidade usando dados de um processo IVT de lote alimentado. Sartorius iniciou IVT com uma proporção de 1:4 de trifosfato de guanosina (GTP) para análogo de cap anti-reverso (ARCA). Após uma hora de processo, a eficiência de capeamento foi alta (80%), mas o rendimento foi baixo. A equipe então usou uma estratégia de alimentação para ajustar os níveis de NTP durante a reação, mantendo a proporção GTP:ARCA. Tais mudanças aumentaram o rendimento em seis vezes (para 11,7 mg/mL) sem diminuir a eficiência de capeamento (80%) ou a qualidade do produto.

Usando esse fluxo de trabalho, os analistas podem obter informações rapidamente sobre o limite de eficiência e rendimento. O software Sartorius PATfix inclui sequências analíticas pré-carregadas e ferramentas para facilitar o monitoramento do processo. A empresa também oferece colunas monolíticas com outras químicas de ligação para fornecer várias ferramentas para fabricação de mRNA e análise de processos.