Transformação foliar para integração aleatória eficiente e modificação direcionada do genoma em milho e sorgo

Nov 12, 2023

Nature Plants volume 9, páginas 255–270 (2023) Citar este artigo

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A transformação em espécies de gramíneas tem tradicionalmente dependido de embriões imaturos e, portanto, tem sido limitada a algumas das principais culturas de Poaceae. Outros explantes de transformação, incluindo tecido foliar, foram explorados, mas com baixas taxas de sucesso, o que é um dos principais fatores que dificultam a ampla aplicação da edição do genoma para melhoramento de culturas. Recentemente, a transformação foliar usando os genes morfogênicos Wuschel2 (Wus2) e Babyboom (Bbm) foi usada com sucesso para mutagênese mediada por Cas9, mas aplicações complexas de edição de genoma, exigindo a triagem de um grande número de plantas regeneradas, permanecem indescritíveis. Aqui, demonstramos que a expressão aumentada de Wus2/Bbm melhora substancialmente a transformação foliar em milho e sorgo, permitindo a recuperação de plantas com desistências de genes mediadas por Cas9 e inserção de genes direcionados. Além disso, usando uma construção Wus2/Bbm otimizada para milho, calos embriogênicos e plântulas regeneradas foram produzidos com sucesso em oito espécies abrangendo quatro subfamílias de gramíneas, sugerindo que isso pode levar a um método universal para transformação e edição de genoma em toda a família Poaceae.

A transformação genética e regeneração de plantas com novos fenótipos foi um avanço na biotecnologia vegetal inicial e gerou grandes expectativas entre os cientistas de plantas. No entanto, logo após o primeiro relato de transformação bem-sucedida de Nicotiana tabacum usando infecção por Agrobacterium1, tornou-se evidente que o tabaco é a exceção e o aproveitamento do potencial dessa tecnologia nas principais culturas seria impedido pela má transformação e/ou regeneração2. Melhorias graduais na transformação continuaram para várias espécies de plantas, mas para muitas delas esse processo foi limitado pela recalcitrância à manipulação in vitro. Encontrar a melhor combinação de método de transformação e sistema de cultura para cada cultura exigiu a avaliação de diferentes explantes, desde células únicas, como protoplastos; a tecidos embrionários como meristema, escutelo ou cotilédones; a tecidos derivados de mudas, como meristemas apicais/axilares, hipocótilo ou folhas; e, finalmente, para alternativas in planta.

O desenvolvimento recente de tecnologias de edição de genoma baseadas em CRISPR (repetições palindrômicas curtas agrupadas regularmente interespaçadas)–Cas (associadas a CRISPR) nucleases exacerba ainda mais a necessidade de processos de transformação aprimorados e eficientes3. As nucleases Cas guiadas por RNA geram quebras de fita dupla direcionadas no genoma, que são reparadas através de vias de junção de extremidade não homóloga (NHEJ) ou reparo direcionado por homologia (HDR). NHEJ é propenso a reparo imperfeito e geralmente resulta em pequenas inserções ou deleções, enquanto HDR pode ser usado para introduzir modificações predefinidas, fornecendo um modelo de DNA doador com regiões de homologia para o local de quebra de fita dupla.

Desde os primeiros relatos de edição de genoma mediada por Cas9 em tabaco, Arabidopsis e arroz, a lista de espécies de plantas editadas continuou a se expandir4,5,6,7. No entanto, enquanto a mutagênese mediada por NHEJ e nocautes de genes são agora práticas comuns, outros tipos de edições do genoma (como inserções de genes mediadas por HDR, deleções em larga escala, inversões e translocações) ocorrem com frequências muito mais baixas, exigindo um grande número de plantas para ser regenerado e rastreado para encontrar um com a modificação desejada. Esta limitação é verdadeira para a maioria das espécies em Poaceae (por exemplo, arroz indica, milho, trigo, cevada, sorgo e milheto), onde os métodos de transformação dependem de embriões imaturos e, em geral, permanecem muito dependentes da espécie e/ou do genótipo. limitando sua implantação em larga escala. Além disso, um fornecimento consistente durante todo o ano de embriões imaturos como um explante de transformação requer uma infraestrutura de estufa que torna os recursos e os custos proibitivos para a maioria das instituições acadêmicas. Consequentemente, instalações de serviços de transformação tornaram-se uma necessidade8. Processos de transformação aprimorados com altas frequências de regeneração, portanto, tornam-se um pré-requisito para esses complexos aplicativos de edição de genoma9.