Um método para rotulagem paralela de proteínas em microescala e controle preciso sobre o grau médio de rotulagem (aDoL)

Jan 10, 2024

Scientific Reports volume 13, Número do artigo: 8961 (2023) Citar este artigo

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Uma abordagem amplamente utilizada para a conjugação de proteínas é através da reação dos resíduos de lisina com NHS- ou outros ésteres ativos. No entanto, é um desafio controlar com precisão o grau de rotulagem (DoL) devido à instabilidade do éster ativo e à variabilidade das eficiências da reação. Aqui, fornecemos um protocolo para um melhor controle de aDoL usando os reagentes de Click Chemistry sem cobre existentes. É uma reação de duas etapas com uma purificação no meio. Resumidamente, as proteínas de interesse foram primeiro ativadas com azida-NHS. Depois de remover azida-NHS não reagida, a proteína-N3 é então reagida com uma quantidade limitada de click tag complementar. Nossos estudos mostraram que o click tag reagirá totalmente com a proteína-N3 após 24 h' de incubação e, portanto, não requer etapas adicionais de purificação. Como tal, o aDoL é igual à razão molar de entrada da click tag e da proteína. Além disso, esta abordagem oferece uma maneira muito mais simples e econômica de realizar rotulagem paralela em microescala. Uma vez que uma proteína é pré-ativada com N3-NHS, qualquer fluoróforo ou molécula com o click tag complementar pode ser anexado à proteína misturando os dois ingredientes. As quantidades da proteína usadas na reação de clique podem ser em qualquer quantidade desejada. Em um exemplo, marcamos um anticorpo em paralelo com 9 fluoróforos diferentes usando um total de 0,5 mg de anticorpo. Em outro exemplo, rotulamos Ab com valor alvo de aDoL de 2 a 8. Em um estudo de comparação de estabilidade, descobrimos que o fluoróforo conjugado usando o protocolo de clique sugerido permaneceu ligado à proteína por mais tempo do que com a marcação de fluoróforo NHS padrão.

As proteínas desempenham um papel central na biologia e torná-las visíveis ou detectáveis ​​é essencial para os pesquisadores estudarem suas funções e interações. Em 2001, Sharpless publicou um artigo de referência descrevendo uma estratégia simples para acoplar duas moléculas "clicando"1. Mais tarde, Meldal e Bertozzi desenvolveram ainda mais a química e a disponibilizaram para ampla aplicação2,3, pelo que 20 anos depois, seus trabalhos foram reconhecidos e premiados com o Prêmio Nobel de Química. A química bioortogonal ou clique química, tem demonstrado grandes vantagens para o direcionamento, com alta especificidade, de proteínas individuais modificadas com sondas ou tags em sistemas complexos4,5,6,7,8,9,10. Também houve outros avanços significativos nos métodos de rotulagem quimio e regiosseletiva para obter uma única marca anexada às proteínas nativas11,12. Para análises abrangentes e livros sobre bioconjugação de proteínas, consulte13,14,15. Também vale a pena mencionar que o resíduo de cisteína é outro alvo popular para a conjugação de proteínas específicas do local. A maioria das proteínas não contém tióis livres nativos que podem ser direcionados, e a redução das pontes dissulfeto pode ter efeitos deletérios na estrutura, portanto, a introdução de um único resíduo de cisteína por meio de mutação pontual é uma abordagem preferencial para ter uma única etiqueta anexada a uma localização precisa da proteína . Independentemente das abordagens mencionadas acima, o éster clássico de N-hidroxissuccinimida (NHS) e outros ésteres ativos permanecem como o grupo funcional preferido para anexar fluoróforo, cromóforo, biotina e DNA a uma proteína via resíduo de lisina16,17. A abundância de resíduos de lisina na maioria das proteínas facilita a rotulagem e é uma reação de uma etapa mais a purificação de uma etapa. No entanto, devido à instabilidade (hidrólise) do éster ativo, inconsistência de eficiências de reação e preocupações de superetiquetagem afetando a função da proteína18, continua sendo uma tarefa assustadora.

Aqui, descrevemos um método de rotulagem que garante aDoL direcionado usando reagentes de química de clique sem cobre prontamente disponíveis. Os sítios de ligação são direcionados estocasticamente para os resíduos de lisina na superfície da proteína, e o aDoL é o número médio de tags (fluoróforos) conjugados a cada proteína. É uma reação em duas etapas com uma etapa de purificação entre elas (mostrada na Fig. 1). Como primeiro passo, a proteína foi ativada com N3-NHS e o excesso de N3-NHS foi removido após a reação. Na segunda etapa, a proteína-N3 foi misturada com o fluoróforo-DBCO em uma razão molar equivalente ao aDoL desejado. Após uma incubação de 24 horas, a proteína marcada está pronta para uso.